TRAAK离子通道第4次跨膜结构对其机械敏感性的作用-项目案例-污水池加盖-反吊膜|膜加盖-除臭加盖-膜结构公司-上海华喜膜结构工程有限公司
网站首页 解决方案 项目案例 新闻动态 膜材介绍 关于华喜 联系方式 EN
首页 > 新闻动态 > 行业动态

TRAAK离子通道第4次跨膜结构对其机械敏感性的作用

发布时间:2020年4月20日 点击数:975

钾离子通道对于人体的神经元放电、心脏跳动以及胰岛素分泌等生理功能具有非常重要的意义[1].钾离子通道通常被分成4大类:电压门控的钾离子通道(Voltage-gated K+channels,KV),钙离子激活的钾离子通道(Calcium-activated K+channels,KCa),内向整流钾离子通道(Inward-rectifying K+channels,Kir)以及双孔钾通道(The two-pore four TM segments K+channels,K2P),前3类通道由4个亚基组成,每一个亚基都为组成孔洞提供了一个螺旋结构域[2,3].然而第4类双孔钾通道不同于其他类型的钾通道,双孔钾通道的一个亚基含有两个孔道区(pore helix 1和pore helix 2),因此双孔钾通道是一个二聚体(dimer)结构而不是四聚体(tetramer)结构.双孔钾通道的一个亚基包含4个跨膜螺旋结构域,分别是M1、M2、M3和M4,在M1和P1(pore domain 1)之间有一个特殊的胞外“盖”(cap)结构[4,5,6].

最近的研究发现,大多数双孔钾通道具有电压依赖性[4,7],通道活性受到多种方式的调节,包括压力、温度、pH、脂质以及药物调控;双孔钾通道主要分成6类,分别是TWIK(Two-P-domain in a weakly inwardly ratifying K+channels)类、TREK(TWIK-related K+channel)类、TASK(TWIK-related acid-sensitive K+channel)类、TALK(TWIK-related alkaline-sensitive K+channel)类、THIK(Tandem pore domain halothaneinhibited K+channel)类以及TRESK(TWIK-related spinal cord K+channel)类[4,8].TREK亚家族通道是目前研究比较深入的双孔钾通道,包含TREK-1、TREK-2以及TRAAK通道,它们在疼痛(pain)、膀胱(bladder)以及窦房结(sinoatrial node)的功能、局部缺血(ischemia)、癫痫(epilepsy)和抑郁症(depression)等方面扮演着重要的角色[9,10,11,12,13,14,15,16].TREK类通道的活性受到溶血磷脂和花生四烯酸等脂质以及pH和挥发性的气体麻醉剂等物质的调节[17,18,19,20,21].TREK亚家族成员(TREK-1、TREK-2和TRAAK)彼此之间可以形成异源二聚体,这些异源二聚体结构种类多样,使双孔钾通道具有了更丰富的功能[22,23].

最近的研究已经将人的TRAAK通道(KCNK4)的4种晶体结构解析出来,PDB ID分别为4I9W、3UM7、4RUF、4RUE[6,24,25].晶体结构显示TRAAK通道是由两个亚基组成,每个亚基有两个孔道区,两个亚基通过在TRAAK通道膜外的“盖”结构域上形成的二硫键连接到一起.根据晶体结构的解析结果,两种TRAAK通道的门控模型被提出,一种是脂质门控模型[24],另一种是跨膜螺旋伸直(straightening)和弯曲(buckling)的门控模型[25].脂质门控模型表明一种脂酰链(lipid acyl chain)通过膜内一个宽的侧孔进入中心腔,然后在物理上阻塞离子通道,形成封闭状态,而跨膜螺旋M4的旋转封住了膜内开口,阻止脂质进入中心腔,从而使离子能够通过通道进行传导,形成开放状态.跨膜螺旋伸直和弯曲的门控模型认为跨膜螺旋M4的倾斜和伸直伴随着跨膜螺旋M2的弯曲来激活TRAAK通道.尽管TRAAK通道的4种晶体结构已经被解析出来,但是TRAAK通道的机械力门控机制仍然不清楚.上述两种TRAAK通道门控模型都表明M4能够影响通道活性,那么M4是否对TRAAK通道的机械力门控也具有重要的作用呢?为了研究这个问题,我们将TRAAK通道的M4区域与非机械敏感性通道TWIK-1的同源区域进行替换[26,27].研究发现TRAAK通道M4的上半部分(PDB:3UM7[6],晶体结构中的氨基酸序列位于248~265aa)对通道的机械敏感性具有重要的调控作用.

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞购自近岸蛋白科技有限公司;LB肉汤培养基和抗生素购自生工生物工程(上海)股份有限公司;2 000bp DNA Marker和Gelstain等化学试剂购自北京全式金生物技术有限公司;氯化钠,氯化钾,HEPES,EGTA等化学试剂购自Sigma公司;胎牛血清购自Vian Saga公司;HEK293T细胞为本实验室保存的细胞系;pIRES-TRAAK-EGFP和pIRES-TWIK-1-EGFP为本实验室保存质粒;引物合成和DNA测序由上海睿迪生物科技有限公司完成;PrimeSTAR MAX DNA Polymerase购自TaKaRa公司;DNA凝胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒以及同源重组酶CloneExpressⅡOne Step Cloning Kit等化学试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司;转染试剂Lipofectamine 3000和P3000购自上海翊圣生物科技有限公司;哺乳动物细胞DMEM培养基购自Sigma公司;高速冷冻离心机购自Eppendorf公司,核酸电泳仪和PCR扩增仪为Bio-Rad公司产品;凝胶成像仪为Clinx公司产品;数模转换器、放大器和显微操作器为AXON公司产品;程控微电极拉制仪为SUTTER公司产品;抛光仪为NARISHIGE公司产品;负压仪器Suction Control Pro unit为Nanion公司产品.

1.2 克隆构建

嵌合突变体M4-chimera的构建:分别以质粒pIRES-TWIK-1-EGFP和pIRES-TRAAK-EGFP为模板,表1中的M4-chimera-F1/R1和M4-chimera-F2/R2为引物进行PCR扩增得到两个目的片段,将目的片段进行凝胶回收,使用同源重组酶进行连接,转化然后挑菌、摇床培养,通过测序和序列比对得到新构建的质粒;分别以新构建的质粒和pIRES-TRAAK-EGFP为模板,表1中的M4-chimera-F3/R3和M4-chimera-F4/R4为引物扩增得到两个目的片段,然后通过凝胶回收、连接和转化等过程得到嵌合突变体M4-chimera.

表1 引物设计 
Tab.1 Primes used for PCR     下载原表

表1 引物设计

嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的构建:分别以表1中的M4-upper-chimera-F/R和M4-lower-chimera-F/R为引物,以pIRES-TRAAK-EGFP为模板进行PCR扩增得到目的基因片段,然后通过凝胶回收、连接和转化等过程得到嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera.

1.3 HEK293T细胞培养及转染

HEK293T细胞培养:在显微镜下观察细胞,细胞生长状态良好(细胞密度均匀,并且细胞没有大量聚集在一起);弃掉培养皿中的培养基,用PBS清洗两次,去除细胞表面杂质;加入1mL浓度为0.25%的胰蛋白酶消化细胞,当细胞开始从培养皿的底部脱落时,吹打细胞,将细胞轻轻悬浮起来;转移细胞至15mL离心管中,加入1mL细胞培养基(DMEM培养基加入10%的澳洲胎牛血清和100×的青霉素-链霉素),1 000r/min离心3min;弃掉上清,加入1mL细胞培养基,悬浮细胞;将200μL细胞转移至含有5mL培养基的细胞培养皿中,在37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养HEK293T细胞.

HEK293T细胞的转染:吸取125μL Opti培养基加入1.5 mL EP管中,然后加入3.75μL的Lipo3000,混合均匀;在另一个EP管中加入125μL Opti培养基,然后加入5μL的P3000和3μg质粒,混合均匀;将两个EP管中的溶液进行混合,室温静置5min,然后将混合液加入HEK293T细胞中.

1.4 电生理实验溶液成分

细胞贴附式记录模式研究TRAAK通道及其突变体半激活压力值(P50)的电极液和浴液成分.

浴液:150mmol/L KCl;5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES;pH 7.2(用KOH调节pH)

电极液:142.5mmol/L NaCl;7.5mmol/L KCl;5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES;pH 7.2(用NaOH调节pH)

全细胞的记录模式研究TRAAK通道及其突变体的全细胞电流的电极液和浴液成分.

浴液:142.5mmol/L NaCl;7.5mmol/L KCl;10mmol/L HEPES和5mmol/L EGTA;pH 7.2(用NaOH调节pH)

电极液:150mmol/L KCl;5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES;pH 7.2(用KOH调节pH)

1.5 细胞贴附式记录

用镊子夹取细胞爬片,置于35mm细胞培养皿中,将细胞培养皿放在载物台上,在显微镜下找到细胞,将生长状态良好并且带有绿色荧光的细胞移至视野中央;用内液冲灌器加电极液并赶走气泡,将电极小心地装在探头上;在显微镜下找到电极(电极电阻为5~7MΩ),移至视野中央,将电极入液,点击膜片钳放大器(Axopatch 700Bamplifier)软件上的第1个auto键,进行液接电位补偿;快速移动显微操作器,将电极靠近细胞,施加负压进行细胞封接,形成细胞贴附式记录模式,利用Clampex 10软件进行数据的采集和分析,用负压仪器Suction Control Pro unit施加压力,10mm汞柱为一个梯度,每次施加压力时间为500ms,直到电流达到最大状态后才停止施加压力.

1.6 全细胞记录

待细胞贴附式记录模式形成后,用注射器缓慢地将细胞吸破,此时仍然保持高阻封接,点击第2个auto键(膜片钳放大器软件第1个auto键的下方),进行快电容补偿,点击第3个auto键,进行细胞电容补偿,形成全细胞记录模式.

1.7 数据处理和分析

利用Clampex 10软件进行电生理数据的采集和分析,利用软件Clampfit 10.4进行电生理数据处理,包括基线的调平,假象信号的去除,数据的统计等;利用GraphPad Prism 6进行半激活压力值(P50值)的计算,电压-电流曲线和直方图的绘制以及曲线的拟合等;实验数据全部用平均值±标准误差(x±S.E.M)表示,实验至少重复4次,用非配对t检验(unpaired t test)的方法统计野生型和突变体之间的差异.

2 结果

2.1 TRAAK通道结构分析以及蛋白序列比对

尽管K2P通道家族具有结构和序列上的保守性,但是它们却表现出不同的功能特征[28].结构和序列保守性为在不同的K2P通道之间进行嵌合突变提供了可行性.为了探讨TRAAK通道机械敏感性的结构基础,我们根据晶体结构信息(PDB:3UM7[6])将TRAAK通道分成8个部分:N端(N terminal domain)和第1次跨膜螺旋结构域(the first transmembrane domain,M1);“盖”结构域(the two-cap domain,Cap);第1个孔道区域(the first pore helix,PH1);第2次跨膜螺旋结构域(the second transmembrane domain,M2);第3次跨膜螺旋结构域(the third transmembrane domain,M3);第2个孔道区域(the second pore helix,PH2);第4次跨膜螺旋结构域(the fourth transmembrane domain,M4);C端(C-terminal domain)(图1(a)).本研究首先通过蛋白序列比对分析得到TRAAK和TWIK-1通道M4区域上的同源序列(图1(b)),利用分子克隆,将TRAAK通道M4区域上的氨基酸序列(PDB:3UM7[6],晶体结构中的氨基酸序列位于248~289aa)替换为TWIK-1上的同源序列,构建了嵌合突变体M4-chimera,在细胞贴附式和全细胞两种记录模式下,研究M4在TRAAK通道机械力门控中的作用.

图1 TRAAK通道结构的8个部分和蛋白序列比对图

图1 TRAAK通道结构的8个部分和蛋白序列比对图   下载原图

Fig.1 Eight parts of the TRAAK channel structure and protein sequence alignment

(a)TRAAK通道8个部分结构图(PDB:3UM7[6]),分别是:N端-M1(红色)、Cap(深蓝色)、PH1(黄色)、M2(粉红色)、M3(浅蓝色)、PH2(棕黄色)、M4(绿色)和C端(银白色);(b)人的TRAAK和TWIK-1蛋白序列比对图,每个部分之间用箭头隔开.

2.2 TRAAK通道及嵌合突变体M4-chimera的全细胞电流和机械敏感性电流记录

在全细胞记录模式下,我们分别记录了野生型TRAAK、嵌合突变体M4-chimera和未转染的HEK293T细胞的全细胞电流(图2(a)、(b)、(c),见第180页).与野生型TRAAK通道相比,嵌合突变体M4-chimera的通道活性消失,不能记录到背景钾离子电流(图2(d)、(e),见第180页).

在细胞贴附式记录模式下,通过负压装置施加压力,本实验分别记录野生型TRAAK和嵌合突变体M4-chimera的机械敏感性电流(图3,见第180页).与野生型TRAAK通道相比,嵌合突变体M4-chimera不能记录到机械敏感性电流,暗示M4-chimera是一个没有活性的通道.

2.3 TRAAK通道嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的全细胞电流记录

为了进一步研究M4在TRAAK通道机械力门控中的作用,我们将M4分成上半部分(PDB:3UM7[6],晶体结构中的氨基酸序列位于248~265aa)和下半部分(PDB:3UM7[6]晶体结构中的氨基酸序列位于266~289aa).与野生型相比,TRAAK通道M4的上半部分被TWIK-1的同源区域替换之后(嵌合突变体M4-upper-chimera),产生了较大的电压依赖性背景钾电流(图4(a)、(c),见第181页).TRAAK通道M4的下半部分被TWIK-1的同源区域替换之后(嵌合突变体M4-lower-chimera),通道活性消失,不能记录到电压依赖性背景钾电流(图4(b)、(c),见第181页),表明M4的下半部分可能对通道活性具有重要的作用.

2.4 M4的上半部分对于TRAAK通道的机械敏感性具有重要的调控作用

在细胞贴附式记录模式下,本实验分别记录嵌合突变体M4-upper-chimera和嵌合突变体M4-lowerchimera的机械敏感性电流(图5(a)、(b),见第181页).嵌合突变体M4-upper-chimera和野生型TRAAK通道的最大机械敏感性电流是没有显著性差异的(图5(c),见第181页),但是嵌合突变体M4-upper-chimera的机械敏感性显著增强,通道半激活压力值(P50)从(102.1±5.6)mmHg下降到(54.04±5.7)mmHg(图5(d)、(e),P<0.001),而嵌合突变体M4-lower-chimera不能记录到机械敏感性电流,表明M4的上半部分能够调控TRAAK通道的机械敏感性.

图2 野生型TRAAK及其嵌合突变体M4-chimera的全细胞电流

图2 野生型TRAAK及其嵌合突变体M4-chimera的全细胞电流   下载原图

Fig.2 Whole-cell currents of wild-type TRAAK and M4-chimera

(a~b)TRAAK(蓝色,PDB:3UM7[6])及其嵌合突变体M4-chimera的突变位点(TWIK-1粉红色PDB:3ukm[5])示意图(上侧),膜电压从-100到+100mV梯度变化记录到的TRAAK(a),嵌合突变体M4-chimera(b)和未转染的HEK293T细胞(c)的全细胞电流(下侧);(d)人的野生型TRAAK(黑色),M4-chimera(蓝色)和未转染的HEK293T细胞(红色)的全细胞电流与电压关系的统计分析;(e)膜电压为+100mV时,未转染的HEK293T细胞,人的野生型TRAAK和M4-chimera的全细胞电流的统计分析,用非配对t检验的方法比较未转染的HEK293T细胞和野生型TRAAK以及M4-chimera的全细胞电流的差异(*P<0.05,ns表示没有显著性差异,n≥5).

图3 野生型TRAAK及其嵌合突变体M4-chimera的机械敏感性电流

图3 野生型TRAAK及其嵌合突变体M4-chimera的机械敏感性电流   下载原图

Fig.3 Mechanosensitive currents of wild-type TRAAK and M4-chimera

(a~b)钳制电压为-60mV,负压力激活TRAAK和嵌合突变体M4-chimera产生的通道电流,从0mmHg开始施加负压,直到电流达到最大状态,10mmHg为一个梯度.

图4 TRAAK通道嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的全细胞电流

图4 TRAAK通道嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的全细胞电流   下载原图

Fig.4 Whole-cell currents of M4-upper-chimera and M4-lower-chimera

(a~b)TRAAK(蓝色,PDB:3UM7[6])嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的突变位点(TWIK-1粉红色,PDB:3ukm[5])示意图(上侧),膜电压从-100到+100mV梯度变化记录到的TRAAK嵌合突变体M4-upper-chimera(a),M4-lower-chimera(b)的全细胞电流(下侧);(c)人的野生型TRAAK(黑色),M4-upper-chimera(黄色),M4-lower-chimera(紫色)和未转染的HEK293T细胞(蓝色)的全细胞电流与电压关系的统计分析,野生型和图2中的野生型为同一组数据,HEK293T和图2中的HEK293T为同一组数据.

图5 M4的上半部分对于TRAAK通道的机械敏感性具有重要的调控作用

图5 M4的上半部分对于TRAAK通道的机械敏感性具有重要的调控作用   下载原图

Fig.5 The upper part of M4can modulate the mechanosensitivity of TRAAK channel

(a~b)钳制电压为-60mV,负压力激活嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera产生的通道电流,从0mmHg开始施加负压,直到电流达到最大状态,10mmHg为一个梯度;(c)野生型TRAAK和嵌合突变体M4-upper-chimera的最大机械敏感性电流的统计分析,用非配对t检验的方法比较野生型TRAAK和M4-upper-chimera的最大机械敏感性电流的差异(ns表示没有显著性差异,n≥5);(d)人的野生型TRAAK(右),嵌合突变体M4-upper-chimera(左)在钳制电压为-60mV时负压力激活的通道电流的拟合曲线;(e)钳制电压为-60mV时,野生型TRAAK及其突变体M4-upper-chimera的P50值的统计分析,用非配对t检验的方法比较野生型和突变体的差异(***P<0.001,n≥5).

3 讨论

机械敏感性离子通道广泛存在于真核生物和原核生物之间,能够将外部机械刺激转化成电信号,参与包括触觉、听觉、血压调节等多种生理过程[29].尽管机械敏感性离子通道具有非常重要的作用,但是人们对其了解仍然非常少,目前研究发现的机械敏感性离子通道包括OSCA[30,31],Piezo[32],TRP[33],K2P[34,35],MscL[36]和MscS[37].

不同的机械敏感性离子通道可能具有特殊的结构区域调控其机械敏感性,例如OSCA通道的M0和M6跨膜螺旋对通道的机械敏感性具有重要的作用[30],并且OSCA通道与钙离子激活的氯离子通道TMEM16A在结构上具有高度的相似性.在TMEM16A通道中,钙离子诱导M6跨膜螺旋变直,从而激活TMEM16A通道[38].OSCA通道可能也具有类似的机制,M6跨膜螺旋变直从而激活OSCA通道[30].K2P通道和TRP通道都具有相似的四聚物拓扑结构(tetramer topology),其中K2P通道的一个亚基包含两个孔道区和两个选择性过滤器[24,39].MscS是七聚体(heptamers)结构[37],在MscS通道激活过程中,3个跨膜螺旋发生了大量的螺旋重排[40].这些机械敏感性通道,从二聚体蛋白到七聚体蛋白,在结构上有比较大的差异性,然而OSCA通道的电生理特性与TREK类通道具有一定的相似性;与经典的机械敏感性通道Piezo相比,OSCA和TREK类通道都能产生比较大的机械敏感性电流,P50的阈值也相对较大[30].本研究发现,TRAAK通道M4的上半部分对通道机械敏感性具有重要的调控作用,由此推测OSCA通道M6的上半部分也可能具有调控该通道机械敏感性的作用.

TRAAK通道的M4通过构象改变,大约在氨基酸残基G268处发生旋转,封堵膜内开口,阻止脂酰链进入中心腔,从而使离子能够进入[24],M4的下半部分可能在M4的旋转中发挥重要的作用,通过控制脂酰链的进入从而影响TRAAK通道的活性.

本研究揭示了TRAAK通道M4的上半部分能够调控TRAAK通道的机械敏感性,但是TRAAK通道作为机械敏感性离子通道,它感受机械力的精准区域尚不清楚.接下来的研究需要找到TRAAK通道上感受机械力的结构区域,进一步阐明TRAAK通道感受机械力的分子机制,这对于研究TRAAK通道的机械力门控机制是至关重要的.本研究接下来的主要工作就是要通过一系列的嵌合突变,将TRAAK通道的其他7个部分(分别是N端-M1、Cap结构、PH1-filter、M2、M3、PH2-filter和C端),依次用非机械敏感性离子通道TWIK-1的同源区域进行替换,分别在全细胞和细胞贴附式两种记录模式下,记录这些嵌合突变体的全细胞电流和负压激活的电流,研究这些部分在通道机械敏感性中的作用.这种通过构建嵌合突变体研究TRAAK通道机械力门控机制的方法,也能够为其他机械敏感性离子通道的机制研究提供新的见解与基础.

下一篇:没有了
专题报道             more...
  • 轨道交通中膜结构的应
    ...

    查看更多

  • 膜结构建筑保温内衬技
    刚查县为青海省海北藏族自治州辖县,青海省措温波高原海滨藏城演艺中心,作为刚查县的标志性建筑,演艺中心为直径50米的圆形建...

    查看更多

  • 膜结构幕墙的应用
    膜结构幕墙是膜结构在建筑外围护结构的应用,具有膜结构的共同特性和优点:膜结构是一种非传统的全新结构方式。...

    查看更多

  • 膜结构屋面的应用
    屋盖是房屋最上部的围护结构,应满足相应的使用功能的要求,为建筑提供适宜的内部空间环境。屋盖也是房屋顶部的承重结构,受到材...

    查看更多

  • 膜结构应用于环保工程
    随着我国国民经济飞速发展和市政基础设施建设全面展开,特别是污水处理厂等环保项目日益增多,其中有相当数量的污水处理厂的厌氧...

    查看更多

  • 膜结构在污水处理厂中
    相当数量的污水处理厂的厌氧池、污泥浓缩池、生物絮凝池等建于居民区、厂区的周边,污水池的环境、风貌及污水臭味等直接影响人们...

    查看更多

关于华喜

硬件实力 质量控制 发展历程 公司简介

软件实力 经营理念  解决方案 联系方式

中国华喜建筑网站

+021-59198545 400-176-6885 dshx@hxmjg99.com www.hxmjg.com 沪ICP备08009856号 使用条款