脂质体由于具有靶向、缓释、增效、减毒等优点, 已成为是中药靶向制剂领域中最受关注的热点之一[1]。脂质体由磷脂和胆固醇构成, 磷脂包括甘油磷脂和鞘磷脂2大类。人们对甘油磷脂研究的较多, 如卵磷脂, 而对结构与卵磷脂相似、同样由亲水亲油基团构成的鞘磷脂研究相对较少。鞘磷脂也能构成生物膜, 且它占红细胞膜外膜磷脂含量的一半以上。由于鞘磷脂形成的是细胞外膜, 比形成细胞内膜的卵磷脂更加牢固, 有更好的刚性、更低的离子渗透性和对血浆的高度耐受性[2,3]。已有文献报道, 鞘磷脂构成的脂质膜比普通细胞膜在血液中更为稳定[4,5,6], 鞘磷脂构成的脂质体还能延长药物在血液循环中的半衰期, 具有长循环的特性[7,8], 因此对鞘磷脂构成的脂质体开展深入研究很有必要。

绞股蓝总皂苷 (gypenosides) 对肝癌、肺癌、食道癌、子宫癌、腹水癌、血癌、皮肤癌等20多种癌细胞有明显的抑制力[9]。绞股蓝总皂苷对肿瘤的抑制作用, 除了直接杀伤瘤细胞, 增强机体免疫功能也是其发挥抗肿瘤作用的重要途径, 其抗肿瘤机制多样[10,11,12,13]、抗肿瘤作用的靶点和途径广泛[14,15], 体现了中医药治疗疾病的特点, 具有很好的开发应用前景[16]。

本研究选用稳定性较好和具有长循环功能的鞘磷脂为膜材制备新型的绞股蓝总皂苷脂质体, 以期用于肝炎、肝癌的治疗, 达到减少给药次数和用药量, 提高病人顺应性等目的。

Zetaplus laser particle size analyzer (Malvern) ;Model RE-52A型旋转蒸发仪 (上海亚荣生物仪器公司) ;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司) ;HZQ-X280恒温振荡培养箱 (太仓市华美生化仪器厂) ;BS210型电子天平;WFJ2000可见分光光度计;KBS-150型数控超声波细胞粉碎机 (昆山市超声仪器有限公司) ;SCZL-A型数字智能控温磁力搅拌器 (郑州长城科工贸有限公司) ;数显恒温水浴锅HH-2 (国华电器有限公司) ;AFM (Veeco公司) 。

胆固醇 (阿拉丁, 批号47269) ;绞股蓝总皂苷 (陕西昂盛生物医药科技有限公司, 批号20120119) ;鱼精蛋白 (Sigma公司, 批号P4672) ;绞股蓝皂苷对照品 (阿拉丁, 批号D100246) ;香草醛 (上海晶纯实业有限公司, 批号v100115) ;鞘磷脂 (Sigma公司, 批号E1028) ;其他试剂为分析纯。

称取绞股蓝总皂苷12 mg、鞘磷脂60 mg、胆固醇30 mg于100 m L烧杯中, 加入乙醇20 m L使之完全溶解。取p H 7.0的磷酸盐缓冲液 (PBS) 20 m L, 预热到45℃, 搅拌下用针头匀速注入烧杯中, 恒温搅拌2 h以除去乙醇, 冰浴条件下探头超声10 min (超声时间2 s, 间隔时间2 s, 功率100W) , 过0.45μm微孔滤膜即得绞股蓝总皂苷脂质体[18]。

称取绞股蓝总皂苷12 mg, 加入PBS 20 m L, 混匀, 备用。称取鞘磷脂60 mg、胆固醇30 mg, 溶于乙醚25 m L, 40℃旋转蒸发至形成均匀的薄膜。加入绞股蓝溶液, 45℃恒温振摇90min, 冰浴条件下探头超声10 min (超声时间2 s, 间隔时间2 s, 功率100 W) , 过0.45μm微孔滤膜即得绞股蓝总皂苷脂质体[19]。

称取鞘磷脂60 mg、胆固醇20mg溶于二氯甲烷25 m L, 置于烧杯中。称取绞股蓝总皂苷12 mg溶于PBS 5 m L, 置于圆底烧瓶中, 将烧杯中的混合液倒入圆底烧瓶中。冰浴条件下探头超声10 min (超声时间2 s, 间隔时间2 s, 功率100W) , 形成均匀乳剂, 旋转蒸发除去二氯甲烷, 形成胶态后加入PBS 20 m L, 继续减压蒸发30 min, 冰浴条件下探头超声10 min (超声时间2 s, 间隔时间2 s, 功率100 W) , 过0.45μm微孔滤膜即得绞股蓝总皂苷脂质体。

参照《中华人民共和国卫生部颁标准》绞股蓝总皂苷项下方法进行。精密称取干燥至恒重的绞股蓝皂苷对照品20 mg定容于10 m L量瓶中, 加入甲醇使其溶解并稀释至刻线, 摇匀。取6支具塞试管, 精密量取对照品溶液0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 m L, 分别置15 m L具塞试管中, 精密加入新鲜配制的含5%香草醛冰醋酸溶液与高氯酸 (2∶8) 的混合液2 m L, 摇匀, 密塞, 置60℃水浴中加热15 min, 取出, 立即放入冰水中冷却2 min, 精密加入冰醋酸10 m L, 摇匀, 以试剂作空白, 照2010年版《中国药典》一部分光光度法项下方法进行试验, 于 (555±5) nm波长处测定吸光度。以吸光度 (A) 为纵坐标, 质量浓度 (C) 为横坐标进行线性回归, 得回归方程A=0.703 9C+0.075 9, r=0.999 0 (线性范围0.203~2.030 g·L-1) 。

吸取脂质体2 m L于10 m L离心管中, 加入鱼精蛋白 (10 g·L-1) 0.5 m L, 搅匀, 静置3 min, 加入生理盐水3 m L, 在室温条件下离心30 min (3 000 r·min-1) , 上清液以生理盐水定容至10 m L。取溶液1 m L, 测定其皂苷量, 即游离药物量。沉淀以10%Triton-100 3 m L溶解, 并补充生理盐水至10 m L。取溶液1 m L, 测定其皂苷量, 即包封药物量, 结果表明, 薄膜分散法、逆向蒸发法、乙醇注入法测得的包封率分别为63.71%, 45.82%, 74.75%。乙醇注入法制备的绞股蓝总皂苷脂质体包封率最佳, 因此选择此法制备绞股蓝总皂苷脂质体, 并用正交试验进行工艺优化。

预试验研究发现药脂比 (总皂苷与鞘磷脂质量比) 、膜材比 (鞘磷脂与胆固醇质量比) 、缓冲液p H、水化温度对脂质体的制备影响较大, 因以药脂比 (A) 、膜材比 (B) 、缓冲液p H (C) 、水化温度 (D) 为考察因素, 脂质体包封率为指标, 用L9 (34) 正交试验对脂质体的制备工艺进行优化, 因素与水平见表1, 结果见表2。

由正交分析可知, 影响脂质体包封率的因素顺序为D>B>A>C, 其中水化温度是影响包封率的主要因素, 与其他因素存在显著性差异。最佳优化的处方和工艺为A2B2C2D2, 即药物与鞘磷脂质量比为1∶10, 鞘磷脂与胆固醇的比例4∶1, 缓冲液p H7.0, 水化温度45℃。

根据上述筛选得到的最佳工艺, 制备3批脂质体样品, 测定其包封率, 结果见表3。3次验证试验的结果基本一致, 说明所确定的优化工艺合理可行, 稳定可靠, 具有可操作和重复性。

采用动态光散射粒径仪检测平均粒径和Zeta电位。激光束波长633 nm, 入射与散射光束夹角173°, 温度25℃。取脂质体溶液100μL, 用水稀释至10 m L, 摇匀平衡3 min后测定, 结果见图1, 2。

粒径与电位图表明, 绞股蓝总皂苷脂质体平均粒径为191.4 nm, 多分散系数 (PDI) 为0.138, 粒径均一, 平均电位为-33.16 m V。

吸取脂质体适量, 将其吸附于盖玻片上, 自然晾干后置原子力电镜下观察, 见图3。绞股蓝总皂苷脂质体均匀圆整, 为球形或近球形, 脂质体的平均粒径<200 nm。

本文研究用鞘磷脂与胆固醇构建脂质体, 采用易于工业化生产的乙醇注入法制备绞股蓝总皂苷脂质体, 并进行了初步的表征。研究结果为新型脂质体的开发做了有益的探索, 具有良好的应用前景。

制备脂质体常用的方法有薄膜分散法、逆向蒸发法、乙醇 (乙醚) 注入法等, 筛选结果最终选择了乙醇注入法, 其优点是操作简单, 可应用于工业化大生产, 为克服粒径不均匀的问题, 研究中增加了探头超声和薄膜过滤处理, 以得到均匀一致的脂质体。

正交试验结果表明, 以鞘磷脂为膜材的脂质体中水化温度对绞股蓝总皂苷包封率影响很大, 这可能是因为鞘磷脂比普通磷脂的相转变温度高所致。在形成脂质体的过程中, 水化温度必须高于所用磷脂的相转变温度, 鞘磷脂的相转变温度则为41℃[21], 所以当温度低于41℃时, 形成不了脂质体, 包封率低;而温度过高, 55℃时, 水分蒸发过大, 易造成脂质体的黏连, 不易通过薄膜过滤, 造成脂质体损失, 最合适的水化温度为45℃。

制备的绞股蓝总皂苷脂质体粒径为191.4 nm, PDI为0.138, 粒径小, 具有靶向功能。该脂质体的Zeta电位为-30 m V以上, 表明具有较好的稳定性[22,23]。

AFM是一种先进的电子显微镜, 能提供真正的三维表面图, 由于三维图形的高分辨率, 常用于各种生物蛋白质、磷脂生物膜等大分子的形貌研究, 本文用AFM对用鞘磷脂为膜材制备出的绞股蓝总皂苷脂质体进行了形态观察。结果表明, 用鞘磷脂和胆固醇制备绞股蓝总皂苷脂质体具有可行性, 制成的脂质体外形圆整、粒径均一。